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植物組織培養褐變產生的因素及對策
文章出處: 作者:hanguang 人氣:0 發表時間:2017-10-12


褐變在許多植物組織培養過程中,常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體,在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐,而且對許多酶有抑製作用,從而影響培養材料的生長與分化,嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防範措施,對天博国际進行科學研究或工廠生產,包括植物組織的培養原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。 

1 褐變的危害 褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表麵培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關係。很多植物,尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物,這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在,因而比較穩定。在切割外植體時,切口附近的細胞受到傷害,其分割狀態被打破,酚類化合物外溢。對於外植體本身來講,酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應,可誘導植保素或無物理屏障的形成,以防止微生物浸染組織。但酚類很不穩定,在溢出過程中與多酚氧化酶接觸,在多酚氧化酶的催化下,迅速氧化成褐色的醌類物質和水,醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下,與外植體組織中的蛋白質發生聚合,進一步引起其他酶係統失活。從而導致組織代謝活動紊亂,生長停滯,最終衰老死亡。此外,由於組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。 

2 褐變產生的機理 

2.1 非酶促褐變 非酶促褐變是由於細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡,即壞死形成的褐變現象,並不涉及酚類物質的產生。將生長正常的愈傷組織轉移到含 NaCl 的培養基中,組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變,但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長,也會發生此類現象但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了。 

2.2 酶促褐變 目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的,培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變如同一般的酶促反應,其發生必須具備三個條件,即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶PPO、過氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和 PPO 的活性來看,表明 PPO 活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物,按其組成可分成三類:苯基羧酸,苯丙烷衍生物,黃烷衍生物,但並非所有的酚類物質都是PPO的底物。在正常發育的植物組織中底物、氧氣、PPO 同時存在並不發生褐變,是因為在正常的組織細胞內由於多酚類物質分布在細胞的液泡內,而PPO則分布在各種質體或細胞質中,這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時,則為酶創造了與PPO接觸的條件,在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌,進行一係列的脫水、聚合反應,最後形成黑褐色物質,從而引起褐變。 

3 褐變產生的影響因素 影響植物組織培養褐變的因子是複雜的,因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態 等不同,褐變的程度也有所不同。 

3.1 植物種類及基因型 在不同植物或同種植物不同基因型的組培過程中,褐變發生的頻率和嚴重程度存在很大的差異,這是由於各種植物所含的單寧及其他酚類化合物的數量不同。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高,更易發生褐變現象。核桃的單寧含量很高,不僅在接種初期發生褐變,在形成愈傷組織後還會因為褐變而死亡;蘋果進行莖尖培養時,不同品種之間褐變的程度也不一樣。對葡萄的研究也發現類似情況。 

3.2 外植體的生理狀態 外植體的生理狀態不同,接種後褐變程度不同。一般外植體的老化程度越高,其木質素的含量也越高,也就越容易褐變,成齡材料一般均比幼齡材料褐變嚴重。另外切口越大,酚類物質的被氧化麵也越大,褐變程度就會更嚴重。因此外植體的受傷程度對褐變的產生具有明顯的影響,傷口加劇褐變的發生。仙客來小葉誘導時,整片葉接種較分成多塊褐變要輕。除機械損傷外,各種消毒劑對外植體的傷害也會引起褐變,對於不易褐變的種類,用升汞消毒後,一般不會引起褐變,若用次氯酸鈉進行消毒,則很容易引起褐變的發生。 

3.3 取材時間和部位 在不同的生長季節,植物體內酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。實驗表明在蘋果和核桃上,冬、春季取材褐變死亡率最低,夏季取材很容易褐變。在取材部位上幼嫩莖尖比其他部位褐變程度低,木質化程度高的節段在進行藥劑消毒處理後褐變現象更為嚴重。 

3.4 培養基 在初代培養中,培養基中無機鹽濃度過高,會引起酚類物質大量產生,導致褐變。BAKT不僅促進酚類化合物合成,而且刺激多酚氧化酶的活性,增加褐變;而生長素類如NAA24-D可延緩多酚合成,減輕褐變。采用液體培養基紙橋培養;可使外植體溢出的有毒物質很快擴散到液體培養基中,效果也很好。 

3.5 光照 在采取外植體前,如果將材料或母株枝條進行遮光處理,然後再切取外植體培養,能夠有效地抑製褐變的發生。將接種後的初代培養材料在黑暗條件下培養,對抑製褐變發生也有一定的效果遮光抑製褐變的原因主要是由於氧化過程中,許多反應受酶係統控製,而酶係統活性受光照影響。但是,暗培養時間過長會降低外植體的生活能力,甚至引起死亡。 

3.6 溫度 高溫促進酚氧化,培養溫度越高,褐變越嚴重,而低溫可抑製酚類化合物氧化,降低多酚氧化酶的活性,從而減輕褐變。在15-25℃下培養卡特蘭,比在25℃以上時褐變要輕,在17℃以下培養天竺葵莖尖比在17-27℃褐變要輕。 

3.7 培養時間 材料培養時間過長,會引起褐變物的積累,加重對培養材料的傷害。蝴蝶蘭、香蕉等隨著培養時間的延長,褐變程度會加劇,甚至在超過一定時間不進行轉接,褐變物的積累還會引起培養材料的死亡。 

4 抑製褐變的措施 從理論上講酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑製:一是除去引起氧化的物質——氧;二是捕捉或減少聚合反應的中間產物;三是抑製有關的酶。實際操作上,下列措施是被認為行之有效的。 

4.1 選擇適當的外植體 取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害,夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長,宜選用早春和秋季的材料作 5為外植體。王異星 用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明,莖最容易誘導出愈傷組織,培養 2周後長出淺黃色的愈傷組織;葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變;而根極大部分不產生愈傷組織,誘導出的愈傷組織全部褐變。 

4.2 對外植體的處理 通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下:外植體經流水衝洗後,在2-5℃的低溫下處理12-24小時,再用升汞或70酒精消毒,然後接種於隻含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天,使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鍾,再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出,3-5天後再轉移培養基2-3次,當外植體的切口愈合後,酚類物質減少,這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑製。用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體,能減輕外植體褐變,從而提高芽叢誘導率。 

4.3 適宜的培養基 培養基的成分與褐變程度有關,要考慮所選培養基的狀態和類型。 

4.4 添加褐變抑製劑和吸附劑 褐變抑製劑主要包括抗氧化劑和PPO抑製劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用,使其重新還原為酚。由於其作用過程均為消耗性的,在實際應用中應注意添加量,其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用,在生產應用中可不受限製。在水稻細胞的培養基中,添加植酸PA,可防止PA褐變,分子中眾多的羥基產生抗氧化作用,使生色物質的含量下降或PAPPO分子中的Cu2結合,從而降低了其活力。陳學森等在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑製多酚氧化酶活性的作用。常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑,能吸附培養基中的有害物質,包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等從而有利於培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強,一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意,盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產生,因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的,在吸附物質的同時,也會吸附培養基中的其他成分,對外植體的誘導分化會產生一定的負麵影響。而聚乙烯吡咯烷酮PVP是酚類物質的專一性吸附劑,在生化製備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑,可用於防止褐變。 

4.5 進行細胞篩選和多次轉移 在組織培養過程中,經常進行細胞篩選,可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天後應立即轉移到新鮮培養基中,能減輕酚類物質對培養物的毒害作用,降低抑製作用,使外植體盡快分生,連續轉移5-6次,可基本解決外植體的褐變問題。 

4.6 其他措施 在外植體接種後1-2天即轉移至新鮮培養基中或同一培養基的不同部位,可以防止酚類物質在傷口周圍積累過多,連續轉移幾次即可防止褐變。此外,在外植體的培養過程中適當縮短轉瓶周期,適當改變培養基的硬度等方法均可減輕褐變的毒害。 

總結 褐變產生的主要因素有兩大類:非酶促褐變,酶促褐變。非酶促褐變是由於外界條件引起的,酶促褐變是由於內在因素引起的。防止褐變的方法有:選擇適當的外植體,對外植體進行處理,使用適宜的培養基,添加褐變抑製劑和吸附劑,進行細胞篩選和多次轉移。


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